1、1.第一步，看箭頭：大多數質粒都會有箭頭，箭頭有兩種解釋。

2、一種是轉錄方向，轉錄方向主要是由啟動子開始的一個大箭頭，是啟動子啟動序列的順序。

(資料圖片)

3、另一種是復制起始位點的方向，復制起始位點就是該質粒在大腸桿菌等細菌或真菌中DNA復制的一個方向。

4、還需要提到的是F1啟動子（圖上的f1 ori）代表的是噬菌體的復制起始方向，只能復制出單鏈的DNA哦，但是可以用來測序。

5、看懂轉錄的方向，這樣就方便設計插入片段的位置和方向性。

6、2.第二步，看上面的標簽。

7、報告基因：通常會有一兩個蛋白，被用作報告基因，比如常見的copGFP（綠色熒光蛋白），Puro（嘌呤霉素），Lacz（乳糖操縱子）等等。

8、和抗性基因不同，這樣的報告基因，并不是為了在大腸桿菌擴增質粒的過程中起作用的。

9、而是在質粒轉入表達體系后起到作用的，基本上就是為了顯示過表達或是敲減的基因是否正常運作。

10、有的報告基因會融合在蛋白中表達，有的會另外用一個獨立的啟動子進行表達（比如shRNA的質粒中）。

11、3.第三步，看多克隆位點：MCS（Multiple Cloning Site，也就是多克隆位點），一般圖中會把多克隆位點上的酶切位點都標記出來。

12、上面的酶切位點順序，一般都是按照5`-3`的順序排列下來的，需要注意的是這樣幾點。

13、第一點是要注意，酶切位點邊標注了*的一般是指并不僅僅存在一個位點，也就不能用來作為構建質粒的酶切位點。

14、第二點需要注意的是，有的酶切位點，在序列中只有一個，但它上面也會標注一個*或者（dam），這說明可能這個酶切位點會有CpG島的甲基化修飾[常見的是XbaI，TCTAG(6m)A中的TC無法切開]，一般也是不能用的。

15、但是非要用這個酶切位點的話，就需要用非甲基化的感受態細胞，如JM109或者JM110。

16、4.第四步，看多克隆位點的序列：末端如果有差異的話，可以把基因的ATG（甲硫氨酸）的5`末端替換1-2個堿基（變成GTG或者GCG這樣），從第二個氨基酸序列開始完全一致即可。

17、而配合擴增和酶切的話，插入片段是允許有3`末端的冗余。

18、為了可以應付3`末端的冗余堿基，在多克隆位點序列后，會有譯碼的終止TAA密碼，即使插入的片段使得3`末端產生了移碼突變，照樣能使表達的蛋白正常終止掉（在酵母雙雜的AD質粒中，由于插入的是隨機cDNA，所以AD的載體上會常見這樣的結構）。

19、擴展資料分類1.根據質粒能否通過細菌的接合作用，可分為接合性質粒和非接合性質粒。

20、接合性質粒帶有與接合傳遞有關的基因。

21、非接合質粒在一定條件下通過與其共存的接合質粒的誘動或轉導而傳遞。

22、2.根據質粒在細菌內的復制類型可分為兩類：嚴緊控制型和松弛控制型。

23、嚴緊控制復制型質粒的復制酶系與染色體DNA復制共用，只能在細胞周期的一定階段進行復制，當細胞染色體停止復制時，質粒也就不再復制。

24、松弛控制復制型的質粒的復制酶系不受染色體DNA復制酶系的影響，在整個細胞生長周期中隨時都可以復制，在染色體復制已經停止時質粒仍能繼續復制。

25、3.根據質粒的不相容性，可分為不相容性和相容性。

26、不相容性指結構相似、密切相關的質粒不能穩定地共存于同一宿主細菌內的現象，反之為相容性。

27、常用于流行病學的調查。

28、參考資料：百度百科-質粒第一步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）Ori的箭頭指復制方向，其他元件標注的箭頭多指轉錄方向（正向）。

29、第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記：（1）Ampr：水解β-內酰胺環，解除氨芐的毒性。

30、（2）tetr ：可以阻止四環素進入細胞。

31、（3）camr：生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

32、（4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。

33、（5）hygr：使潮霉素β失活。

34、第三步：看多克隆位點（MCS）。

35、它具有多個限制酶的單一切點，便于外源基因的插入。

36、如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。

37、決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

38、第四步：再看外源DNA插入片段大小。

39、質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。

40、一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。

41、第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。

42、這是用來區別克隆載體與表達載體。

43、克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。

44、選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。

45、擴展資料：啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號啟動子－促進DNA轉錄的DNA順序，這個DNA區域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA分子上可以與RNApol特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。

46、增強子/沉默子－為真核l基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。

47、其作用與增強子所在的位置或方向無關。

48、即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。

49、沉默子－負增強子，負調控序列。

50、核糖體結合位點/起始密碼/SD序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是AUG（起始密碼）和SD序列。

51、轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。

52、結構基因的最后一個外顯子中有一個AATAAA的保守序列，此位點down－stream有一段GT或T富豐區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。

53、參考資料來源：百度百科-質粒一、一個合格質粒的組成要素 復制起始位點Ori，即控制復制起始的位點。

54、原核生物DNA 分子中只有一個復制起始點。

55、而真核生物DNA 分子有多個復制起始位點。

56、 抗生素抗性基因：可以便于加以檢測，如Amp+ ，Kan+ 多l 克隆位點：MCS 克隆攜帶外源基因片段 P/E：啟動子/增強子 Terms：終止信號 加poly（A）信號：可以起到穩定mRNA 作用 二、如何閱讀質粒圖譜 第一步：首先看Ori 的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒） Ori 的箭頭指復制方向，其他元件標注的箭頭多指轉錄方向（正向）。

57、 第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記： （1）Ampr：水解β -內酰胺環，解除氨芐的毒性。

58、 （2）tetr ：可以阻止四環素進入細胞。

59、 （3）camr：生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

60、 （4）neor（kanr）：氨基糖苷磷酸轉移酶，使G418（卡那霉素衍生物）失活。

61、 （5）hygr：使潮霉素β 失活。

62、 第三步：看多克隆位點（MCS）。

63、它具有多個限制酶的單一切點，便于外源基因的插入。

64、如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。

65、決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

66、 第四步：再看外源 DNA 插入片段大小。

67、質粒一般只能容納小于10Kb 的外源DNA 片段。

68、一般來說，外源DNA 片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。

69、 第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。

70、這是用來區別克隆載體與表達載體。

71、克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。

72、選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。

73、 相關概念： 啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號 啟動子－促進DNA 轉錄的DNA 順序，這個DNA 區域常在基因或操縱子編碼順序的上游，是DNA 分子上可以與RNApol 特異性結合并使之開始轉錄的部位，但啟動子本身不被轉錄。

74、 增強子/沉默子－為真核 l 基因組（包括真核病毒基因組）中的一種具有增強鄰近基因轉錄過程的調控順序。

75、其作用與增強子所在的位置或方向無關。

76、即在所調控基因上游或下游均可發揮作用。

77、沉默子－負增強子，負調控序列。

78、 核糖體結合位點/起始密碼/SD 序列（Rbs/AGU/SDs）：mRNA 有核糖體的兩個結合位點，對于原核而言是AUG（起始密碼）和SD 序列。

79、 l 轉錄終止順序（終止子）/翻譯終止密碼子：結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－stream 有一段 GT 或 T 富豐區，這2部分共同構成 poly （A）加尾信號。

80、結構基因的最后一個外顯子中有一個 AATAAA 的保守序列，此位點 down－ stream 有一段GT 或T 富豐區，這2部分共同構成poly（A）加尾信號。

81、 三、載體及其分類 載體：即要把一個有用的基因（目的基因——研究或應用基因）通過基因工程手段送到生物細胞（受體細胞），需要運載工具（交通工具）攜帶外源基因進入受體細胞，這種運載工具就叫做載體（vector）。

82、 P.S.基因工程所用的vector 實際上是DNA 分子，是用來攜帶目的基因片段進入受體細胞的DNA。

83、 載體的分類 按功能分成：（1）克隆載體：都有一個松弛的復制子，能帶動外源基因，在宿主細胞中復制擴增。

84、它是用來克隆和擴增DNA 片段（基因）的載體。

85、（所以有時實驗時擴增效率低下，要注意是不是使用的嚴謹型載體）（2）表達載體：具有克隆載體的基本元件（ori,Ampr,Mcs 等）還具有轉錄/翻譯所必需的DNA 順序的載體。

86、 按進入受體細胞類型分：（1）原核載體（2）真核載體（3）穿梭載體（sbuttle vector）指在兩種宿主生物體內復制的載體分子，因而可以運載目的基因（穿梭往返兩種生物之間）。

87、 P.S. 穿梭質粒含原核和真核生物2個復制子，以確保兩類細胞中都能擴增。

88、 基因工程載體的3個特點： （一）都能獨立自主的復制：載體DNA 分子中有一段不影響它們擴增的非必需區域，如 MCS，插在其中的外源DNA 片段，能被動的跟著載體一起復制/擴增，就像載體的正常成分一樣。

89、 （二）都能便利的加以檢測： 如載體的藥物抗性基因，多是抗生素抗性基因，將受體細胞放在含有該抗生素培養板上培養生長時，只有攜帶這些抗性基因的載體分子的受體細胞才能存活。

90、 （三）都能容易進入宿主細胞中去，也易從宿主細胞中分離純化出來。

91、 四、載體的選擇和制備 選擇載體主要依據構建的目的，同時要考慮載體中應有合適的限制酶切位點。

92、如果構建的目的是要表達一個特定的基因，則要選擇合適的表達載體。

93、 載體選擇主要考慮下述3點： 構建DNA 重組體的目的，克隆擴增/表達表達，選擇合適的克隆載體/表達載體。

94、 2、載體的類型： （1）克隆載體的克隆能力－據克隆片段大小（大選大，小選小）。

95、如小于10kb 選質粒。

96、 （2）表達載體據受體細胞類型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳類細胞表達載體。

97、 （3）對原核表達載體應該注意3點： ①選擇合適的啟動子及相應的受體菌； ②用于表達真核蛋白質時注意克服4個困難和閱讀框錯位； ③表達天然蛋白質或融合蛋白作為相應載體的參考。

98、 3、載體 MCS 中的酶切位點數與組成方向因載體不同而異，適應目的基因與載體易于鏈接，不產生閱讀框架錯位。

99、選用質粒（最常用）做載體的4點要求： ①選分子量小的質粒，即小載體（1－1.5kb）→不易損壞，在細菌里面拷貝數也多（也有大載體）； ②一般使用松弛型質粒在細菌里擴增不受約束，一般10個以上的拷貝，而嚴謹型質粒小于10個。

100、 ③必需具備一個以上的酶切位點，有選擇的余地； ④必需有易檢測的標記，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（試一試）。

101、 無論選用哪種載體，首先都要獲得載體分子，然后采用適當的限制酶將載體DNA 進行切 割，獲得分子，以便于與目的基因片段進行連接。

102、 二、pET32a(+)自身載體表達的片段大小 The expected fusion protein expressed encoded by just the pET-32a(+) vector alone would be around 20.4 kDa. The Trx-tag by itself would contribute 12kDa. The rest is due to the two His-tags (0.8kDa each) and the S-tag (1.7kDa). The remaining 5.1kDa is due to the intervening（?） 54 amino acids between the tags and until the stop codon. 三、pET32系列載體的載體序列地址 四、pET 系列載體閱讀方法 ori 是復制起始點，細的黑箭頭是幾個不同的轉錄區，其箭頭方向不同，說明每個表達產物（如kan 抗性基因、LacI 等）都有獨立的promoter，有時與T7 promoter 方向相反。

103、粗的黑箭頭是MCS，用于目的基因的插入，箭頭方向表明目的基因的轉錄方向，它的轉錄方向可以與其它幾個不同的轉錄區相同，也可以不同，如 Kan 抗性基因、LacI 的方向是一樣的，可能與調控相關，不同的載體是不一樣的。

104、一個載體可只看它的啟動子到終止子那一段，其它的可以考慮少些。

105、 五、pET 表達菌株的相關信息 （ DE3 ）指宿主為 λ DE3 溶原菌，其染色體上帶有一拷貝由 lacUV5 啟動子控制的 T7 RNA 聚合酶基因。

106、這類菌株適用于從克隆到 pET 載體的目標基因生產蛋白。

107、命名為 pLysS 和 pLysE 的宿主菌帶有編碼 T7 溶菌酶（為 T7 RNA 聚合酶的天然抑制物）的 pET 相容性質粒。

108、帶有 pLysS 的細胞產生少量溶菌酶，而 pLysE 宿主菌產生更大量酶。

109、這些菌株用于在誘導前抑制 T7 RNA 聚合酶的基礎表達，這樣可以穩定編碼影響細胞生長和活力的目標蛋白的 pET 重組體。

110、帶有 pLacI 的宿主菌產生額外的抑制 pETBlue 和 pTriEx 載體基礎表達的 lac 阻遏蛋白。

111、 λ DE3 溶原化試劑盒用于制備其它遺傳背景的新表達宿主菌。

112、 AD494 菌株為硫氧還蛋白還原酶 ( trxB ) 突變菌株，能夠在胞漿內形成二硫鍵，提供了生產正確折迭的活性蛋白的潛力。

113、 TrxB 突變可用卡那霉素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla 的質粒。

114、 B834 為 BL21 的親本菌株。

115、這些蛋白酶缺陷宿主菌為甲硫氨酸營養缺陷型，可用 35 S- 甲硫氨酸和硒代甲硫氨酸對目標蛋白進行高特異活性標記，從而用于結晶學研究。

116、 BL21 應用最廣的宿主菌來源，具有 lon 和 ompT 蛋白酶缺陷的優點。

117、 BL21 TrxB 菌株在蛋白酶缺陷 BL21 背景上具有與 AD494 菌株相同的硫氧還蛋白還原酶突變 ( trxB ) 。

118、由于 trxB 宿主有利于胞漿內二硫鍵形成，它們的使用可增加正確折迭的蛋白組分。

119、 TrxB 突變可用卡那霉素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla 的質粒。

120、 BLR 為 BL21 的 recA - 衍生菌株，能夠改善質粒單體產量，有助于穩定含有重復序列或其產物能夠引起 DE3 噬菌體丟失的目標質粒。

121、 HMS174 菌株在 K-12 背景上提供了 recA 突變。

122、與 BLR 一樣，這些菌株能夠穩定其產物能夠引起 DE3 噬菌體丟失的某些目標基因。

123、 NovaBlue 適合 用作初始克隆宿主菌的 K-12 菌株，具有高轉化效率、藍 / 白斑篩選能力（與合適質粒）和導致優質質粒 DNA 高產的 recA endA 突變。

124、由于存在 F 附加體編碼的 lacI q 阻遏蛋白， NovaBlue 的 DE3 溶原菌是一個非常有用的嚴緊型宿主菌。

125、 Origami 為 K-12 衍生的宿主菌，硫氧還蛋白還原酶突變 ( trxB ) 和谷胱甘肽還原酶 ( gor ) 基因均為突變，能夠大大增強胞漿內二硫鍵的形成。

126、研究表明即使總體表達水平相似， Origami （ DE3 ）表達的活性蛋白比其它宿主菌高 10 倍以上。

127、 Origami 宿主菌與氨芐抗性質粒相容，可用于 pET-32 載體，硫氧還蛋白標簽能夠進一步增強在胞漿內形成二硫鍵。

128、 TrxB 和 gor 突變可分別用卡那霉素和四環素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla 的 pET 質粒。

129、 Origami B 宿主菌來源于 BL21 lacZY 突變株，還帶有與原始 Origami 菌株相同的 TrxB / gor 突變。

130、 Origami B 菌株集 BL21 、 Tuner 和 Origami 宿主菌的優點于一體。

131、 TrxB 和 gor 突變可分別用卡那霉素和四環素選擇，因此該菌株建議用于帶氨芐抗性標記 bla 的 pET 質粒。

132、 Rosetta 宿主菌從 BL21 衍生而來，可增強帶有大腸桿菌稀有密碼子的真核蛋白的表達。

133、該菌株通過一個相容性氯霉素抗性質粒補充密碼子 AUA 、 AGG 、 AGA 、 CUA 、 CCC 和 GGA 的 tRNAs 。

134、這樣 Rosetta 菌株提供了“萬能”的翻譯，從而避免因大腸桿菌密碼子使用頻率導致的表達限制。

135、 tRNA 基因由它們的天然啟動子驅動。

136、在 Rosetta （ DE3 ） pLysS 和 Rosetta （ DE3 ） pLacI 中，稀有 tRNA 基因存在于分別帶有 T7 溶菌酶和 lac 阻遏基因的同一質粒上。

137、 Tuner 菌株為 BL21 的 lacZY 缺失突變株，能夠調整培養物中所有細胞的蛋白表達水平。

138、 lac 通透酶（ lacY ）突變使得 IPTG 均勻進入群體所有細胞，從而具有濃度依賴、水平均一的誘導表達。

139、通過調整 IPTG 濃度，表達可從極低水平調節到極強、完全誘導的表達水平（通常與 pET 載體相關）。

140、低水平表達有時可能增強難表達蛋白的溶解性和活性。

141、 Tuner （ DE3 ） pLacI 菌株與 pETBlue 和 pTriEx 載體的表達相容。

142、方法一：使用Vector NT 軟件做分子實驗，經常和不同的質粒打交道，了解各種質粒的圖譜信息是必需的，invitrogen公司的這款軟件絕對是分子生物學蟲子們的福音，要想對質粒圖譜了解更直觀，安裝這款軟件是非常必要的。

143、這款軟件的軟件包里面會包括invitrogen公司的所有質粒圖譜信息和其他比較常見和經典的質粒圖譜。

144、方法二：查找質粒圖譜的網站Vector Database（addgene）這個網站很頁面很人性化，以前叫做lablife，現在網站做了整合，比如查找pRS類質粒圖譜（注意，是一類質粒圖譜，沒關系，照樣能找到），直接在搜索框輸入pRS，可以看到，之類質粒一共有三十多個。

145、找到自己需要的質粒名稱，點擊進入，就可以看到質粒圖譜了。

146、如何閱讀質粒圖譜第一步：首先看Ori的位置，了解質粒的類型（原核/真核/穿梭質粒）第二步：再看篩選標記，如抗性，決定使用什么篩選標記。

147、（1）Ampr 水解β－內酰胺環，解除氨芐的毒性。

148、（2）tetr 可以阻止四環素進入細胞。

149、（3）camr 生成氯霉素羥乙酰基衍生物，使之失去毒性。

150、（4）neor（kanr） 氨基糖苷磷酸轉移酶 使G418（長那霉素衍生物）失活（5）hygr 使潮霉素β失活。

151、第三步：看多克隆位點（MCS）。

152、它具有多個限制酶的單一切點。

153、便于外源基因的插入。

154、如果在這些位點外有外源基因的插入，會導致某種標志基因的失活，而便于篩選。

155、決定能不能放目的基因以及如何放置目的基因。

156、第四步：再看外源DNA插入片段大小。

157、質粒一般只能容納小于10Kb的外源DNA片段。

158、一般來說，外源DNA片段越長，越難插入，越不穩定，轉化效率越低。

159、第五步：是否含有表達系統元件，即啟動子－核糖體結合位點－克隆位點－轉錄終止信號。

160、這是用來區別克隆載體與表達載體。

161、克隆載體中加入一些與表達調控有關的元件即成為表達載體。

162、選用那種載體，還是要以實驗目的為準繩。

本文到此分享完畢，希望對大家有所幫助。

關鍵詞： 表達載體 克隆載體 酶切位點